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大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验方法及结果判断

一、简介

大肠埃希氏菌(E.Coli,简称大肠杆菌)于1885年由德国科学家T. Escherich从健康婴儿粪便中分离并命名。

大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型,可引起腹泻、出血性肠炎,极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症,死亡率高。于1982年在美国被首次发现,此后在世界各地散发或地方流行,1996年在日本大阪地区发生流行,患者逾万,死亡11人,1999-2000年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7事件,导致l77人死亡。世界卫生组织已将O157:H7列为新的食源性病原菌。

二、参考标准

《GB 4789.36-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM 检验》

三、检验方法以及结果分析

1.分离

样品经mEC+n肉汤增菌后大肠埃希氏菌o157:h7/nm,划线接种于大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上,36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落形态。该培养基的特异性高,可以克服SMAC培养基引起的假阳性和假阴性结果,是一种很理想的快速检测培养基。在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征为显亮红色、淡红色或红色,菌落周围没有蓝色晕圈。如下图所示:

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

图1 在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板菌落特征

2.初步生化试验

在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5~10个可疑菌落,分别接种TSI琼脂,同时接种MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株(ATCC 25922)做阳性对照,于36℃±1℃培养18h~24h。

在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)。

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

A:空白对照;B:大肠埃希氏菌O157

图2 TSI琼脂试验结果

置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MUG试验阴性,无荧光;大肠埃希氏菌株ATCC 25922为MUG试验阳性性,有荧光且产气。

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

A:空白对照;B:大肠埃希氏菌O157;C:大肠埃希氏菌ATCC 25922

图3 MUG-LST肉汤试验结果

3.染色镜检

挑取纯培养的单个可疑菌落,进行革兰氏染色,大肠埃希氏菌O157为革兰氏阴性菌,镜检为红色杆状。如下图所示:

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

图4 革兰氏染色镜检

4.生化鉴定及结果分析

自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。可使用海博生物生化试验培养基干粉自行配制,也可使用O157菌成套生化鉴定管或HBIO157菌生化鉴定条(GB)。

1)山梨醇发酵试验

大肠埃希氏菌O157能够发酵山梨醇产酸,使培养基pH下降,培养基变为黄色,大肠埃希氏菌ATCC 25922不能利用山梨醇,培养基变为蓝色或蓝绿色yabo网页登入 ,如下图所示:

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

A:空白对照;B:大肠埃希氏菌O157;C:大肠埃希氏菌ATCC 25922

图5 山梨醇发酵管试验结果

2)靛基质试验

含有色氨酸酶的细菌,能分解蛋白胨中的色氨酸,形成靛基质(吲哚)。靛基质无色,当加入对氨基苯甲酸试剂后,形成可见的红紫色醌式化合物,即玫瑰靛基质。大肠埃希氏菌O157接种至蛋白胨水培养基,36℃±1℃培养18-24h后,加Kovacs靛基质试剂0.2 mL~0.3 mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。如下图所示:

大肠埃希氏菌o157:h7/nm

A:空白对照;B:大肠埃希氏菌O157;C:鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028

图6 靛基质试验结果

3)MR-VP试验

甲基红(MR)试验:接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR-VP),36℃±1℃培养2d~5d。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。大肠埃希氏菌O157培养基管变为红色,为MR阳性结果,如下图所示:

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